Лаборатория Информационного Конструирования - 353784
тел: 8(861)261-95-30
+7(918)333-22-76

"Здесь фигуры, здесь цвета, здесь все образы частей вселенной сведены в точку.
Какая точка столь чудесна?
О, дивная, изумляющая необходимость, ты понуждаешь своими законами все действия быть кратчайшим путем причастными причин своих.
Это чудеса, которые..." Леонардо Да Винчи

Технологии

ОТЧЕТ №1

по проекту «Изучение влияния внешних воздействий (изделие «Светлица») на биологические объекты различной степени сложности (биохимические свойства, устойчивость, продуктивность)»

Работа выполнена в течение июня-ноября 2001 г. в Межведомственной лаборатории экологической и медицинской биохимии Якутского госууниверситета и Института биологических проблем криолитозоны СО РАН.

Исполнители:

к.х.н., д.б.н., проф.Кершенгольц Б.М.

к.м.н., доцент Мельцер И.М.

м.н.с. Филиппова Г.В.

аспирант Шаройко В.В.

Сохранение устойчивости любых биологических структур (а также их продуктивности, начиная с клеточного уровня организации) при действии на них стресс-факторов внешней среды любой природы зависит от способности совокупности биохимических реакций, организующих их, протекать в режиме самоорганизации [1]. В свою очередь, это новое качество систем химических реакций, как известно, связано с их удаленностью от термодинамического равновесия, нелинейностью и каталитичностью (ферментативностью). В значительной степени способность систем химических реакций протекать в «саморегуляторной» области фазового пространства зависит, во-первых, от широты спектра изоструктурности биологически активных веществ (как энзимов, так и низкомолекулярных БАВ способных посттрансляционно модифицировать активность ферментов). Во-вторых, от их способности влиять на надмолекулярную, кластерную структуру воды в этих системах.

Вышесказанное позволяет выделить биологические (биохимические) объекты различной степени сложности молекулярной организации для изучения влияния изделия «Светлица» на их свойства, а также критерии оценки.

В качестве объектов были взяты:

- пероксидаза - моносубъединичный энзим;

- алкогольдегидрогеназа - дисубъединичный, четвертичный регуляторный фермент;

- культура клеток лейкоцитов крови человека.

Методы оценки реакций:

- молекулярных систем – изменения каталитических характеристик и стабильности ферментов;

- реакций культуры клеток – изменения интенсивности процессов матрич-ных биосинтезов (репликации, трансляции), активности защитных антиоксидантных и ДНК-репарационных систем, устойчивости генома (разработанный комплексный метод оценки этих характеристик описан в работе  [2]).

 

1. Пероксидаза из корней хрена (стандартный препарат, фирмы «Koch-Light Laboratories”, Англия, показатель чистоты RZ = D403/D280=3,0 – препарат 98,9% чистоты). Пероксидаза из корней хрена (ПХ) – глобулярный гемсодержащий белок; мол.масса – 40 кД; диаметр глобулы ≈ 50Ао; конформация стабилизирована тремя S-S связями, образованными шестью остатками цистеина. ПХ относится к цитоплазматическим (водорастворимым) гликопротеидам – белковая глобула связана с 6-8 олигосахаридами. Известно 7 изоферментов пероксидазы, несколько различающиеся между собой аминокислотным составом (первичной структурой) и составом олигосахаридов. Это приводит к различиям количественных характеристик каталитических свойств, термо- и рН-стабильнос-ти, электрофоретической подвижности и т.д. [3].

Пероксидаза имеет широкую субстратную специфичность, катализирует реакции окисления многих неорганических и органических (фенолов, ароматических аминов и т.д.) соединений перекисью водорода или органическими перекисями. Поскольку как фенолы и ароматические амины, так и перекиси являются токсичными для клетки (организма) веществами, то пероксидазу называют «дворником клетки» от эндогенных и экзогенных токсинов. Так как в пероксидазной реакции происходит восстановление перекиси до воды, пероксидаза относится и к антиоксидантам.

В качестве модельной пероксидазной реакции мы изучили реакцию окисления о-дианизидина (ароматического диамина) перекисью водорода по стандартным методикам в фосфатном 0,1 М буферном растворе рН 7,0 [4]. рН 7,0 буферного раствора было взято в целях снижения вероятности влияния изделия «Светлица» на кислотно-щелочное равновесие воды.

Результаты изучения влияния изделия «Светлица» на каталитические свойства и термостабильность ПХ (n=9) представлены в табл.1.

Анализ данных, приведенных в табл.1 показывает, что изделие «Светлица» не оказывает влияния на активность ПХ при его воздействии только на буферный раствор, не содержащий фермента в период воздействия. Т.е. изделие «Светлица» не оказывает влияния на водные растворы в отсутствие биологически активных веществ (БАВ).

 

Таблица 1.

Изменение каталитических свойств и термостабильности пероксидазы из корней хрена при действии на нее изделия «Светлица», рН 7,0

Условия

kкат, сек-1,

при 20оС

КМ по Н2О2, мкМ,

при 20оС

КМ по о-диа-низидину мкМ, при 20оС

kинакт*104, мин-1

при 40оС,

1. Контроль

510 ± 13

46 ± 4

15 ± 2

8,0 ± 0,3

2. Буферный раствор выдержан 1 сутки на изделии «Светлица».

 

530 ± 10

 

48 ± 4

 

16 ± 2

 

7,9 ± 0,3

 

3. Буферный раствор выдержан 1 сутки на изделии «Светлица», затем внесена ПХ и раствор выдержан еще 30 минут.

 

 

450 ± 9 *)

 

 

31 ± 3 *)

 

 

10 ± 1 *)

 

 

6,5 ± 0,3 *)

*) Различия достоверны

 

Однако изделие «Светлица» достоверно оказывает небольшое влияние на свойства ПХ, заключающиеся в небольшом снижении ее молекулярной активности (на 12%), при увеличении сродства (чувствительности; снижении КМ) фермента к субстратам (к о-дианизидину – на 50%, к перекиси водорода – на 48%) и его термостабильности при 40оС на 23%.

С точки зрения выполнения пероксидазой своей биохимической функции - «дворника клетки» от токсичных ароматических  соединений и перекисей последнее является наиболее важным, т.к. снижение Км означает, что фермент начинает контролировать (превращать) более низкие концентрации субстратов.

Учитывая гликопротеидную природу пероксидазы (т.е. способность создавать мощную структурированную гидратную оболочку в микроокружении фермента), эффект можно объяснить следующим образом. Изделие «Светлица», вероятно, по принципу «структурного подобия» влияет на надмолекулярную кластерную структуру воды, но не свободной, а находящейся в первоначально структурированном (организованном) состоянии. Т.е., воды, находящейся в многослойных гидратных оболочках гликопротеидов (ПХ). Изменение надмолекулярной структуры воды приводит к изменениям в системе слабых взаимодействий (водородных связей) в системе гликопротеид-(Н2О)n. Это, в свою очередь, приводит к изменениям конформации (трехмерной структуры) глобулы фермента, также в первую очередь образованной системой слабых взаимодействий (водородных и гидрофобных). Изменения конформации приводят к изменениям каталитических параметров и других физико-химических свойств. Причем эти изменения оказываются направленными на повышение функциональной активности и значимости фермента – в случае пероксидазы, на снижение концентрации токсичных для клетки веществ – перекисей и токсичных ароматических аминов и фенолов.

 

2. Алкогольдегидрогеназа (АДГ) печени лошади (стандартный препарат фирмы «Reanal», Венгрия), доочищенный по стандартным методикам до 85-90 %-ой степени чистоты [6]. Концентрацию АДГ находили методом титрования активных центров фермента хлор- и гидроксимеркурибензоатом [7]. Фермент состоит из двух глобул несколько различающихся друг от друга аминокислотным составом и первичной структурой. Молекулярная масса фермента в целом составляет около 80 кД. В каждую из субъединиц входит по атома Zn, один из которых непосредственно участвует в структурной организации активного центра. Связи между субъединицами осуществляют слабые взаимодействия.

АДГ катализирует обратимую реакцию окисления спиртов в альдегиды, коферментом является НАД. АДГ печени обладает достаточно широкой субстратной специфичностью. Ее субстратами являются первичные и вторичные алифатические спирты, альдегиды и кетоны, ароматические спирты и альдегиды, ретинол и другие полиеновые спирты, диолы, пантотениловый спирт, стероиды, 5-оксиэтилтиозол и другие. То есть, биохимической функцией фермента является регуляция уровней эндогенных биогенных спиртов и альдегидов, а также инактивация их экзогенных токсичных аналогов, попадающих в организм [8]. К функциям АДГ относится участие в обмене катехоламинов – нейрохимических медиаторов, нейроопиоидных пептидов и морфиноподобных веществ в структурах головного мозга и ЦНС, в частности отвечающих за формирование интеллектуально-эмоциональной сферы, уровня психической, физиологи ческой и физической активности.

Известно до 15 изоферментов АДГ, образующихся за счет кодирования субъединиц несколькими аллельными локусами генома и различных комбинаций субъединиц в димерах [9].

В качестве модельной алкогольдегидрогеназной реакции мы изучили реакцию окисления этанола с участием НАД (рН 10,0; kкат.1) и восстановления ацетальдегида с участием НАДН (рН 6,5; kкат.2), по стандартным методикам [8].

Результаты изучения влияния изделия «Светлица» на каталитические свойства и термостабильность АДГ (n=11) представлены в табл.2.

Анализ данных, приведенных в табл.2 показывает, что изделие «Светлица» не оказывает влияния на активность АДГ при его воздействии только на буферный раствор, не содержащий фермента в период воздействия. Т.е. и в экспериментах с АДГ подтверждено, что изделие «Светлица» не оказывает влияния на водные растворы в отсутствие биологически активных веществ (БАВ).

 

Таблица 2.

Изменение каталитических свойств (при 20оС) и термостабильности АДГ из печени лошади при действии на нее изделия «Светлица»

Свойства АДГ

Контроль

Буферный раствор выдержан 1 сутки на изделии «Светлица».

Буферный раствор выдержан 1 сутки на изделии «Светлица», затем внесена АДГ и раствор выдержан еще 30 минут.

kкат1, мин-1, рН 10,0

20 ± 2

18 ± 2

12 ± 2 *)

КМ по этанолу, мкМ,

рН 10,0

500 ± 25

510 ± 24

340 ± 12 *)

КМ по НАД, мкМ,

рН 10,0

85 ± 5

89 ± 4

70 ± 4 *)

kкат2, мин-1, рН 6,5

58 ± 6

54 ± 5

75 ± 5 *)

КМ по ацетальдегиду, мкМ, рН 6,5

300 ± 15

310 ± 15

116 ± 12 *)

КМ по НАДН, мкМ,

рН 6,5

100 ± 6

105 ± 6

80 ± 6 *)

kинакт*103, мин-1

при 36оС,

5,5 ± 0,3

5,3 ± 0,3

3,3 ± 0,2 *)

*) Различия достоверны

 

Однако влияние изделия «Светлица» на каталитические свойства и термостабильность АДГ существенно более выражено, чем на соответствующие свойства пероксидазы. А именно, каталитическая активность в реакции восстановления ацетальдегида (наиболее токсичного вещества) возрастает на 29%, в реакции образования ацетальдегида из этанола – снижается  на 47%. Значительно возрастает чувствительность фермента к этанолу (на 47%), особенно к ацетальдегиду – в 2,6 раза, при умеренном возрастании чувствительности к НАД и НАДН (на 21-25%). Термостабильность  АДГ при 36оС возрастает на 67%.

Видно, что влияние изделия «Светлица» на каталитические свойства АДГ  наиболее ярко проявляется в отношении основной биохимической функции – контролировать (снижать) уровень наиболее активных химических соединений – альдегидов. Т.е. и в случае с АДГ изделие «Светлица», прежде всего, относительно избирательно активирует дезинтоксикационную функцию фермента. Причем это влияние проявляется более резко, чем на ПХ, по-видимому, потому что АДГ имеет более высокий уровень структурной организации и изоферментной гетерогенности.

 

3. Культура клеток лейкоцитов крови человека. Венозную кровь человека, взятую с гепарином, культировали (инкубировали) на изделии «Светлица» в течение 2 суток при температуре 38оС, на соответствующей среде, как описано в работе [10]. Отделяли лейкоцитарные клетки, определяли их митотический индекс (МИ), скорость включения 3Н-тимидина в ДНК и 14С-лейцина в белки (с t1/2>24 часов), концентрацию низкомолекулярных антиоксидантов (НМАО; веществ, инактивирующих свободные радикалы, образующихся в том числе при превращении активных форм кислорода) и активность супероксиддисмутазы (СОД) – фермента, инактивирующего наиболее активный свободный радикал кислорода (-О2*), образующийся при присоединении неспаренного электрона к молекуле кислорода (табл.3).

Определение всех этих параметров позволило рассчитать уровень антиоксидантной защиты клеток, активность ДНК-репарационных систем («второй эшелон» защиты генома от действия мутагенов), устойчивость генома по формулам, приведенным в работе [2] (табл.3).

Было обследовано 12 человек. По характеристикам лейкоцитов крови они были дифференцированы на 2 группы (табл.3).

Анализ результатов, приведенных в табл.3 показывает, что изделие «Светлица» оказывает нормализующее влияние на очень сложно-организованные структурно-функциональные системы клеток крови человека (лейкоцитов). К числу последних относятся системы с очень широким структурным разнообразием или включающие полиферментные комплексы (системы наиболее вариабельных матричных биосинтезов, к которым нельзя отнести репликацию – процесс клеточного деления):

- НМАО, обладают очень высоким структурным разнообразием – изменение активности в 1,5-9,8 раз;

- системы трансляции (синтеза белков; полиферментный инфоромационнопреобразующий комплекс) – изменение активности в 2,0-4,3 раза;

- системы репарации (исправления мутаций) ДНК (обладают и изоферментным разнообразием и полиферментностью) - изменение активности в 2,6-4,0 раза.

Наиболее ярко нормализующее влияние изделия «Светлица» по изменению самых интегральных коэффициентов, характеризующих два основных свойства всей совокупности клеточных биохимических систем – устойчивости и продуктивности генетического аппарата клетки (kустойч.генома и kпродуктив.генома; табл.3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 3.

Влияние  изделия «Светлица» на свойства антиоксидантных и геномных систем лейкоцитов крови человека (в скобках нормированные значения)

 

Свойства лейкоцитов

Норма

(n=30) [11]

Контроль №1

Кровь пациентов группы №1 инкубирована 2 суток на изделии «Светлица»

Контроль №2

Кровь пациентов группы №2 инкубирована 2 суток на изделии «Светлица».

1. [НМАО],

мкг-эквив. кверцитина/мл

1,02±0,07

(1,0)

0,68±0,05

(0,67)

1,02±0,07

(1,0)

0,10±0,01

(0,1)

0,98±0,07

(0,96)

2. СОД,

мкмоль/мл*мин

0,28±0,02

(1,0)

0,25±0,02

(0,89)

0,29±0,02

(1,0)

0,19±0,02

(0,68)

0,23±0,02

(0,82)

3. 3Н-тимидина, фмоль/мл *сутки

0,85± 0,02

(1,0)

2,3± 0,1

(2,70)

0,56± 0,02

(0,66)

0,3± 0,02

(0,35)

1,0± 0,02

(1,18)

4. 14С-лейцина, nмоль/мл *сутки    (kтрансляции)

0,65±0,02

(1,0)

0,14±0,01

(0,22)

0,60±0,02

(0,92)

1,2±0,04

(1,85)

0,60±0,02

(0,92)

5. МИ, % (kрепликации)

8,5±1,5

(1,0)

7,9±1,5

(0,93)

7,9±1,5

(0,97)

7,7±1,5

(0,90)

8,6±1,5

(1,01)

6. kАОЗ,

нормир.ед.

1,0

0,78

1,0

0,14

0,89

7. kОАГ,

нормир.ед.

1,0

1,46

0,79

1,1

1,05

8. kрепарации,

нормир.ед.

1,0

2,77

 

0,69

0,45

1,17

9. kустойч.генома,

нормир.ед.

1,0

1,34

 

0,94

0,20

1,0

10. kпродуктив. генома, нормир.ед.

1,0

0,58

 

0,95

1,38

0,97

Где, kАОЗ – коэффициент антиоксидантной защиты клеток;

kтрансляции –  интенсивность синтеза белков с t1/2>24 часов;

kрепликации – интенсивность процессов клеточного деления;

kОАГ - коэффициент общей активности генома клеток;

kрепарации - коэффициент активности систем репарации ДНК;

kустойч.генома – коэффициент устойчивости генома;

kпродуктив.генома - коэффициент продуктивности генома

 

Учитывая, что объектами в этой части работы были клетки лейкоцитов, в популяцию которых входят лимфоциты (иммунокомпетентные клетки), можно отметить, что результаты, приведенные в табл.3 указывают на иммунонормализующую функцию изделия «Светлица». Последнее является наиболее актуальным при профилактике и лечении не только инфекционных заболеваний, но и болезней, в патогенезе которых происходит активация аутоиммунных процессов (хронические обструктивные бронхиты и астма, гепатиты, болезни зависимости, онкопатологии, проявления предрасположенности к эндокринным нарушениям, болезни стресса и многие другие).

 

В заключение можно сделать предположения о планировании следующего этапа работ по изучению механизмов изделия «Светлица» на еще более сложные объекты – биологические организмы, включая человека. По-видимому, эти работы должны включать одновременный анализ как интегральных свойств организма (Кирлиановского излучения), так и конкретных внутриклеточных ключевых биохимических систем (скорости матричных биосинтезов; активность защитных систем, включая антиоксидантные, ДНК-репарационные и системы клеточного апоптоза).

 

Выводы:

1. Изучение влияния изделия «Светлица» на биохимические объекты в ряду усложнения их структуры (моносубъединичные ферменты, полисубъединичные энзимы, полиферментные системы непосредственно в клетках) показало, что оно способно оказывать влияние на функционально активные ферменты и ферментные комплексы, активируя те их свойства, которые обуславливают выполнение основной метаболической функции - прежде всего, дезинтоксикационной или нормализующей гомеостаз. Причем, по мере расширения изоструктурного спектра этих БАВ, либо увеличения степени полимолекулярности ферментных комплексов эффект многократно усиливается.

2. Наиболее ярко (из числа изученных молекулярных систем) влияние изделия «Светлица» проявляется на низкомолекулярных антиоксидантных системах (обладают широким структурным спектром) и на наиболее функционально вариабельных системах матричных биосинтезов (трансляции, репарации ДНК).

3. На наиболее сложных из изученных биохимических систем ярко проявляется нормализующее влияние изделия «Светлица», приводящее к восстановлению гомеостатического равновесия между основными группами характеристик клетки – устойчивостью и продуктивностью.

4. Сделаны предположения о механизмах формирования эффекта, связанных с влиянием изделия «Светлица» на структуру надмолекулярных комплексов молекул воды (систему слабых взаимодействий в них), входящих в многослойное микроокружение БАВ (белков и др.), изменение которой способно влиять на систему слабых взаимодействий, определяющих конформацию БАВ, следовательно, их функциональные свойства и активность.

5. Сформулированы задачи следующего этапа исследования направленного на комплексное изучение влияния изделия «Светлица» на еще более сложные объекты (целостные организмы). Исследование должно включать одновременный анализ как интегральных свойств организма (Кирлиановского излучения), так и конкретных внутриклеточных ключевых биохимических систем (скорости матричных биосинтезов; активность защитных систем, включая антиоксидантные, ДНК-репарационные и системы клеточного апоптоза).

Литература.

1. Пригожин И., Стенгерс И. Порядок из хаоса (новый диалог человека с природой). М.: Эдиториал УРСС. 2000. 312 с.

2. Журавская А.Н., Филиппов Э.В., Кершенгольц Б.М. Влияние физиолого-биохимических адаптаций ольхи кустарниковой к повышенному естественному радиационному фону на выживаемость проростков и радиочувствительность ее семян // Радиобиология. Радиоэкология. 2000. – Т.40, №3. – С.254-260.

3. Березин И.В., Угарова Н.Н., Кершенгольц Б.М. Каталитические свойства и стабильность пероксидазы иммобилизованной в полиакриламидном геле //Биохимия. - Т.41, N9. - 1976. -  С.1662-1670.

4. Кершенгольц Б.М. Исследование некоторых свойств пероксидазы из хрена в растворимом и иммобилизованном состояниях // Автореф.дисс. на соискание уч.степ.канд.хим. наук. М. Изд-во. МГУ. 1975. 20с.

5. Березин И.В., Угарова Н.Н., Кершенгольц Б.М. Микроокружение ферментов как один из факторов, определяющих их стабильность //Докл. АН СССР. - Т.223,-1975.- С 1256-1259.

6. Кершенгольц Б.М., Рогожин В.В. Влияние межсубъединичных взаимодействий в АДГ из печени лошади на кинетику окисления этанола //Биохимия. - Т.44, №4. - 1979,  - С.661-671

7. Рогожин В.В., Говорова Т.П., Кершенгольц Б.М. Селективнй метод титрования активных центров алкогольдегидрогеназы хлор- и гидроксимеркурибензоатом // Биоорг.химия. - Т.14, № 12. - 1988. - С.1626-1632.

8. Кершенгольц Б.М. Этанол и ацетальдегид в организмах растений и животных // Автореф.дисс. на соискание уч.степ.докт.биол. наук. М. Изд-во. МГУ. 1991. 49с.

9. Кершенгольц Б.М., Ильина Л.П. Биологические аспекты алкогольных патологий и наркоманий (учебное пособие) // Якутск: Изд-во ЯГУ. 1998. 150 с.

10. Кершенгольц Б.М., Журавская А.Н., Мельцер И.М., Шаройко В.В. и др. Заключительный научный отчет (1997-2000гг.) по теме “Физиологически активные вещества в организмах растений и животных Севера и их роль в формировании оптимальных соотношений устойчивости и продуктивности”, // №ГР 01.9.90000.701, Т.6 Якутск, ИБПК СО РАН, 2000. – 318 с.

11. Кершенгольц Б.М., Мельцер И.М., Шаройко В.В. и др. Заключительный научный отчет (1999-2000) по теме «Изучение активности и устойчивости систем, защищающих и «лечащих» геном клеток растений, животных и человека в условиях Якутии» // Якутск, ЯГУ и ИБПК СО РАН (грант Департамента по охране генофонда народов РС(Я)). 2000. – 101 с.

 

 

 

 

 

 

 

 

Войти







© ООО Лаборатория Информационного Конструирования 2012

Адрес: 350000, г. Краснодар,
ул.Калинина, 341, оф.308
Тел: 8(861)261-95-30
+79183332276
E-mail: 3332276@mail.ru
icq: 325 233 555
Skype: ludmila33322

ООО Лаборатория Информационного Конструирования

Верстка и продвижение - World Web Site